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    靈芝多糖的常規(guī)提取方法已有報(bào)道，這些方法不僅費(fèi)時(shí)，而且收率很低。目前，超聲技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的提取，作者采用該方法提取靈芝多糖，不僅大幅度提高了有效成分的提取率，節(jié)省溶劑，簡(jiǎn)化提取步驟，而且避免了高溫對(duì)有效成分的破壞。為探討靈芝多糖超聲法好的提取條件，采用正交設(shè)計(jì)對(duì)其提取工藝進(jìn)行了試驗(yàn)研究。

1　儀器與材料

　　超聲波提取罐JP600G（武漢嘉鵬電子有限公司）；雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)760 CRT（上海光學(xué)儀器廠）；高速中藥粉碎機(jī)HX-200型（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52 A （上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴鍋；索氏提取器；高速離心機(jī)。

　　靈芝由國(guó)家科技部泰山赤靈芝GAP種植基地提供，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川副教授鑒定為Gan- o&mla lucidum Kalst；新配0.2%蔥酮醋酸乙酯試劑，無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（105℃干燥恒重）及其他分析純?cè)噭?/span>

2　方法與結(jié)果

2.1　靈芝多糖的提取與精制

　　稱取靈芝粉末30g,乙醚480mL回流脫脂2 次，每次1h;再用甲醇480mL回流提取2次，每次1 h。藥渣加水360mL,沸水浴提取2次，每次1.5h，合并2次提取液，高速離心機(jī)2400r·min-1，離心20 min。減壓濃縮至350mL，活性炭脫色，過(guò)濾，濾液加乙醇使其含醇量達(dá)百分之八十，放置過(guò)夜，抽濾，沉淀以 200 mL水溶解重復(fù)醇沉1次。沉淀分別以無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，60℃干燥，即得靈芝多糖。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.2.1 0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制 精密稱取干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖0.1g,配成100mL溶液，即得 0.1％葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2.2 0.2%蒽酮-醋酸乙酯顯色劑的配制　精密稱取0.4g蒽酮，溶于200mL醋酸乙酯，搖勻，置于棕色瓶中保存。

2.2.3　多糖吸收波長(zhǎng)的測(cè)定　精密吸取0.1% 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1.0mL，用蒸餾水定容至50mL，取1 mL放于干燥的10mL具塞試管中，再加入4mL濃 H2SO4，搖勻，5min后加1mL 0.2%蒽酮-醋酸乙酯， 100℃水浴加熱10min取出，放至室溫。掃描條件：狹縫2.00nm，采樣間隔1.00nm，在500～700nm進(jìn)行慢速掃描。測(cè)得靈芝多糖的吸收波長(zhǎng)可達(dá)618 nm，吸光度為0.116，透過(guò)率為76.6%。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，用蒸餾水分別定容至50mL，分別取1mL加入干燥的6支 10mL具塞試管中，并編號(hào)，再分別加入4mL濃硫酸，搖勻，5min后加1mL 0.2%蒽酮-醋酸乙酯，100 ℃水浴10min取出，放至室溫。取1mL蒸餾水，以濃硫酸為空白對(duì)照，618nm測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，無(wú)水葡萄糖含量為橫坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A＝0.006 6×C-0.0739，r=0.9992，表明 20～120μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.3 換算因素的測(cè)定

　　精密稱取靈芝多糖18.00mg,置100mL量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，取2mL用蒸餾水定容至10mL，得多糖供試液。精密吸取1mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算出多糖溶液中葡萄糖的含量，并計(jì)算出換算因子f =W/CD。式中 W為多糖量（μg），C為多糖溶液中葡萄糖的含量，D 為靈芝多糖的稀釋因素。測(cè)得f=1.7948.

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　以溫度、料液比（藥材：水）、提取時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)3因素,3水平的L9（34）試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1　因素及水平

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A B C

水平　 溫度　 時(shí)間　 藥材:水

/℃ /min

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1 40 20 1:10

2 50 40 1:20

3 60 60 1:30

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2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

　　精取靈芝3g,按正交試驗(yàn)表所列條件，超聲提取2次，過(guò)濾，合并提取液，濃縮并定容至100mL。精密吸取0.15mL，加水0.85mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算出供試液中葡萄糖的含量，并計(jì)算多糖含量(％)=CDF/W×100。式中C為供試液中葡萄糖的濃度（μg·mL-1），D為供試品溶液的稀釋因子,f為換算因子，W為供試品重量（μg）。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 試驗(yàn)結(jié)果

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No. 多糖含量/％

1 2.3953

2 2.6443

3 2.9177

4 3.1435

5 2.5129

6 3.2448

7 2.4773

8 2.5679

9 2.3584

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表3 方差分析結(jié)果

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方差來(lái)源 離均差平方和 自由度 均方 F P

A 0.3823 2 0.1911 1.097 ＞0.05

B 0.1081 2 0.0540 0.310 ＞0.05

C 0.3484 2 0.1742 0.048 ＞0.05

誤差 0.0168 2 0.0083

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注：F0.05(2，2)＝19.00

　　以多糖含量百分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，各因素作用主次為A＞B＞C。方差分析表明，A，B，C3因素對(duì)結(jié)果均無(wú)顯著性影響，故依據(jù)直觀分析結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)成本，選擇靈芝多糖的好的提取工藝為 A2B1C1，即10倍量水50℃超聲提取2次，每次20min。

2.6　多糖含量測(cè)定

2.6.1　常規(guī)方法　精取靈芝粉末5g,乙醚100mL 回流脫脂2次，每次1h;再用甲醇100mL回流提取 2次，每次1h。藥渣加水80mL,沸水浴提取2次，每次1.5h，合并2次提取液，高速離心機(jī)2 400r· min-1，離心20min。上清液減壓濃縮至60mL，加乙醇使其含醇量達(dá)百分之八十，放置過(guò)夜，抽濾，沉淀以水溶解并定容至100mL。精密量取0.15mL，加水0.85 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算出多糖含量為1.60％。

2.6.2 超聲方法 精取靈芝粉末3g,加10倍量水 50℃超聲提取2次，每次20min，合并提取液，過(guò)濾，濃縮并定容至100mL，作為樣品供試液。精密吸取 0.15mL,加水0.85mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算出靈芝多糖含量為2.57%，較常規(guī)方法提高60.61％。

3 討論

3.1 本研究采用正交試驗(yàn)，根據(jù)方差分析和生產(chǎn)實(shí)際情況確定了靈芝多糖超聲提取好的工藝，即 10倍量水50℃超聲提取2次，每次20min;并且考察了該方法的可行性和實(shí)用性，若確定以靈芝多糖作為質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)時(shí)，靈芝多糖的提取可用該方法進(jìn)行。

3.2 比較了常規(guī)提取和超聲提取靈芝多糖的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用超聲提取靈芝多糖具有較大的優(yōu)勢(shì)：提取時(shí)間縮短5倍以上，收率提高百分之六十以上；提取全過(guò)程無(wú)需高溫，避免了因高溫對(duì)靈芝多糖分子結(jié)構(gòu)的分解，而常規(guī)提取會(huì)破壞多糖的分子結(jié)構(gòu)降低多糖的活性；所用儀器簡(jiǎn)單，操作方便，超聲波儀自動(dòng)化程度很高，便于大規(guī)模生產(chǎn)。 （中國(guó)中藥雜志第30卷第6期）

　　產(chǎn)品型號(hào)：JP600G型超聲波提取/乳化機(jī)組

　　機(jī)型結(jié)構(gòu)：超聲波發(fā)生器與提取罐分體式

　　超聲頻率：28KHz

　　超聲峰值功率：1000W （由原600W升級(jí)至1000W，價(jià)格不變）

　　提取罐內(nèi)尺寸：直徑320 ×高250mm

　　提取罐容積：小于等于20L

　　攪拌電機(jī)功率：15W

　　攪拌電機(jī)轉(zhuǎn)速：10-30轉(zhuǎn)/min（可調(diào)）

　　電加熱功率：2KW

　　供電電源：220VAC 50HZ 

　　具有數(shù)顯時(shí)鐘可調(diào)功能

　　具有數(shù)顯功率可調(diào)功能

　　具有數(shù)顯掃頻可調(diào)功能

　　具有數(shù)顯溫度可調(diào)功能

　　武漢嘉鵬電子有限公司專業(yè)致力于超聲波提取/萃取、超聲波乳化、超聲波清洗、超聲波污水處理、超聲波酒類(lèi)醇化產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)及銷(xiāo)售。公司擁有多項(xiàng)技術(shù)。其中“數(shù)字式大功率多用途超聲波電源系統(tǒng)”獲武漢市重大科技成果獎(jiǎng)。數(shù)字掃頻實(shí)現(xiàn)了用戶迫切需要的變頻要求的同時(shí)還彌補(bǔ)了早期雙頻或多頻技術(shù)帶來(lái)的超聲轉(zhuǎn)換效率很低的弊端。此項(xiàng)技術(shù)經(jīng)由全國(guó)各大院校的用戶使用后反應(yīng)很好。應(yīng)用于植物提取、乳化、污水處理等領(lǐng)域，院校包括：清華大學(xué)、北京大學(xué)、浙江大學(xué)、華中科技大學(xué)、武漢大學(xué)、華中師大、中國(guó)地質(zhì)大學(xué)、武漢科技大學(xué)、上海交大、浙江工業(yè)大學(xué)、蘭州大學(xué)、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)、武漢化工學(xué)院、吉林大學(xué)、四川大學(xué)、華南理工大學(xué)、華東理工大學(xué)、江漢大學(xué)、長(zhǎng)江大學(xué)、中科院武漢植物所、昆明植物所、中科院過(guò)程所、中科院武漢物理所、武漢市藥檢所等。公司產(chǎn)品行銷(xiāo)全國(guó)除港、澳、臺(tái)外的所有省份及直轄市。售后方面：公司產(chǎn)品使用自主技術(shù)故性能穩(wěn)定、質(zhì)量很好。公司承諾5年內(nèi)免費(fèi)質(zhì)保。用戶采用超聲波需注意的事項(xiàng)：超聲波提取方面：一、被提取物需粉碎到20目或更細(xì)。粉碎越細(xì)得率越高。二、選用合適的提取溶劑。三、根據(jù)產(chǎn)品的特性和產(chǎn)量合理的安排提取工藝。

　　超聲波乳化方面：一、乳化液的配方包括乳化劑的用量。二、乳化時(shí)間的選定，并不是時(shí)間長(zhǎng)就越好，乳化過(guò)程是分散和聚合不停的循環(huán)的過(guò)程。按現(xiàn)有試驗(yàn)結(jié)果顯示10－15分鐘的乳化粒徑可達(dá)100納米。

　　重要的是數(shù)字掃頻的選擇，此項(xiàng)共有16檔選擇，數(shù)值越低則氣泡越粗、力量越大；數(shù)值越高則氣泡越細(xì)、力量越小。不同的提取或乳化物質(zhì)改變數(shù)字掃頻會(huì)帶來(lái)不同的效果及效率。

　　超聲波提取天然產(chǎn)物包括超聲波提取多肽、氨基酸、核酸、各種酶類(lèi)、單糖、寡糖、多糖、糖蛋白、樹(shù)脂、膠體物、木質(zhì)素、維生素、脂肪、油脂、蠟、生物堿、揮發(fā)油、黃酮、糖苷類(lèi)、苯丙素類(lèi)、有機(jī)酸、酚類(lèi)、醌類(lèi)、甾體化合物、抗生素類(lèi)等。